Protokolle zur Isolierung und Expansion von MSCs aus der Wharton-Sulze
Die Methodik im Detail: Isolierung, Charakterisierung, Qualitätskontrolle und Expansion im großen Maßstab von mesenchymalen Stammzellen aus der Wharton-Sulze für die klinische Anwendung.
Explantat
Isolierungsmethode
Hypoxie 3 %
Kulturbedingungen
P5 (34-fach)
Expansionskapazität
7 Prüfpunkte
Qualitätskontrolle
Isolierungsprotokoll
Die Nabelschnüre stammen aus gesunden, termingerechten Geburten und werden nach Einwilligung der Mutter gewonnen. Innerhalb von 4 Stunden nach der Geburt werden sie unter GMP-konformen Bedingungen aufbereitet. Die Wharton-Sulze wird von den Nabelschnurgefäßen und der Amnionmembran getrennt und anschließend mit einem optimierten Explantatverfahren weiterverarbeitet, das die Viabilität der Zellen erhält und zugleich eine hohe Ausbeute sichert.
Die Zellen werden in xenofreien, serumfreien Medien mit humanem Thrombozytenlysat (hPL) unter hypoxischen Bedingungen (3 % O₂) kultiviert. Im Vergleich zur normoxischen Standardkultur (21 % O₂) steigert dies nachweislich die Teilungsfähigkeit, die parakrine Sekretion und die immunmodulatorische Wirkstärke.
Expansionskinetik: Hypoxie vs. Normoxie (Vervielfachung)
Isolierungsmethoden im Vergleich
Immunphänotypisierung: Expression der Oberflächenmarker
| Marker | Expression (%) | ISCT-Kriterium | Status |
|---|---|---|---|
| CD73 | 99.2% | >95 % | ✓ Positiv |
| CD90 | 98.7% | >95 % | ✓ Positiv |
| CD105 | 97.4% | >95 % | ✓ Positiv |
| CD34 | 0.3% | <2 % | ✓ Negativ |
| CD45 | 0.5% | <2 % | ✓ Negativ |
| CD14 | 0.2% | <2 % | ✓ Negativ |
| HLA-DR | 1.1% | <2 % | ✓ Negativ |
Prüfungen vor der Chargenfreigabe
| Prüfung | Spezifikation | Ergebnis |
|---|---|---|
| Sterilität (USP <71>) | Kein Wachstum nach 14 Tagen | Bestanden |
| Endotoxine (LAL) | <5 EU/kg | 0,8 EU/kg |
| Mykoplasmen (PCR) | Nicht nachweisbar | Nicht nachweisbar |
| Karyotypanalyse | Normal 46,XX oder 46,XY | Normal |
| Viabilität (Trypanblau) | >90 % | 97,2 % |
| Genauigkeit der Zellzählung | ±10 % | ±4,3 % |
| Differenzierung in drei Zelllinien | Bestätigt | Bestätigt |
Die wichtigsten Ergebnisse
- •Die Isolierung per Explantat erzielt die höchste Viabilität (97,8 %) und erhält die Stammzelleigenschaften am besten.
- •Die hypoxische Kultur (3 % O₂) erreicht bis Passage 5 eine 2,2-fach höhere Expansionskapazität als die Normoxie.
- •Alle Chargen erfüllen durchgehend die ISCT-Mindestkriterien zur Identifizierung von MSCs.
- •Xenofreie, mit hPL angereicherte Medien schließen die Risiken von fetalem Kälberserum aus.
- •Ein umfassendes Prüfprogramm mit 7 Prüfpunkten sichert Sicherheit, Sterilität und Wirkstärke jeder für die klinische Anwendung freigegebenen Charge.
Ausgewählte Literatur
- Dominici M, et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. Cytotherapy. 2006;8(4):315-317.
- Batsali AK, et al. Mesenchymal stem cells derived from Wharton's Jelly of the umbilical cord. World J Stem Cells. 2013;5(2):43-56.
- Mushahary D, et al. Isolation, cultivation, and characterization of human mesenchymal stem cells. Cytometry A. 2018;93(1):19-31.
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