Protocoles d'isolement et d'expansion des CSM de la gelée de Wharton
Méthodologie détaillée de l'isolement, de la caractérisation, du contrôle qualité et de l'expansion à grande échelle des cellules souches mésenchymateuses issues de la gelée de Wharton, pour des applications cliniques.
Explants
Méthode d'isolement
Hypoxie à 3 %
Conditions de culture
P5 (× 34)
Capacité d'expansion
Panel de 7 contrôles
Contrôles qualité
Protocole d'isolement
Les cordons ombilicaux sont prélevés lors d'accouchements à terme de femmes en bonne santé, après consentement éclairé. Ils sont traités dans les 4 heures suivant l'accouchement, dans des conditions conformes aux BPF. La matrice de gelée de Wharton est séparée des vaisseaux ombilicaux et de la membrane amniotique, puis traitée selon une méthode d'explants optimisée qui préserve la viabilité cellulaire tout en maintenant un rendement élevé.
Les cellules sont cultivées dans un milieu sans composants d'origine animale et sans sérum, additionné de lysat plaquettaire humain (hPL), en conditions d'hypoxie à 3 % d'O₂. Il a été montré que ces conditions améliorent la capacité de prolifération, la sécrétion paracrine et la puissance immunomodulatrice par rapport à une culture normoxique standard (21 % d'O₂).
Cinétique d'expansion : hypoxie comparée à la normoxie (facteur d'expansion)
Comparaison des méthodes d'isolement
Immunophénotypage : expression des marqueurs de surface
| Marqueur | Expression (%) | Exigence ISCT | Statut |
|---|---|---|---|
| CD73 | 99.2% | >95 % | ✓ Positif |
| CD90 | 98.7% | >95 % | ✓ Positif |
| CD105 | 97.4% | >95 % | ✓ Positif |
| CD34 | 0.3% | <2 % | ✓ Négatif |
| CD45 | 0.5% | <2 % | ✓ Négatif |
| CD14 | 0.2% | <2 % | ✓ Négatif |
| HLA-DR | 1.1% | <2 % | ✓ Négatif |
Contrôles qualité avant libération des lots
| Test | Spécification | Résultat |
|---|---|---|
| Stérilité (USP <71>) | Aucune croissance à 14 jours | Conforme |
| Endotoxines (LAL) | <5 UE/kg | 0,8 UE/kg |
| Mycoplasmes (PCR) | Non détectés | Non détectés |
| Analyse du caryotype | Normal 46,XX ou 46,XY | Normal |
| Viabilité (bleu trypan) | >90 % | 97,2 % |
| Exactitude du comptage cellulaire | ±10 % | ±4,3 % |
| Différenciation en trois lignées | Confirmée | Confirmée |
Principales conclusions
- •L'isolement par explants donne la viabilité la plus élevée (97,8 %) et préserve au mieux le caractère souche des cellules.
- •La culture en hypoxie (3 % d'O₂) donne une capacité d'expansion 2,2 fois supérieure au passage 5, par rapport à la normoxie.
- •Tous les lots répondent de façon constante aux critères minimaux de l'ISCT pour l'identification des CSM.
- •Un milieu sans composants d'origine animale, additionné de hPL, élimine les risques liés au sérum de veau fœtal.
- •Un panel complet de 7 contrôles qualité garantit la sécurité, la stérilité et la puissance de chaque lot libéré pour un usage clinique.
Références choisies
- Dominici M, et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. Cytotherapy. 2006;8(4):315-317.
- Batsali AK, et al. Mesenchymal stem cells derived from Wharton's Jelly of the umbilical cord. World J Stem Cells. 2013;5(2):43-56.
- Mushahary D, et al. Isolation, cultivation, and characterization of human mesenchymal stem cells. Cytometry A. 2018;93(1):19-31.
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